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  南方医科大学学报  2019, Vol. 39Issue (3): 320-327  DOI: 10.12122/j.issn.1673-4254.2019.03.10.
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周燕霞, 胡韦维, 张虹洋, 邹琳, 张鹏辉. 利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因c.392G>T (p.131G>V)突变位点的HEK293T稳定细胞株[J]. 南方医科大学学报, 2019, 39(3): 320-327. DOI: 10.12122/j.issn.1673-4254.2019.03.10.
ZHOU Yanxia, HUI Weiwei, ZHANG Hongyang, ZOU Lin, ZHANG Penghui. Establishment of a stable HEK293T cell line with c.392G>T (p.131G>V) mutation site knockout in G6PD gene using CRISPR/Cas9 technique[J]. Journal of Southern Medical University, 2019, 39(3): 320-327. DOI: 10.12122/j.issn.1673-4254.2019.03.10.

基金项目

重庆市社会民生科技创新专项(Cstc2016shmszx130032)

作者简介

周燕霞, 在读硕士研究生, E-mail: 1032110546@qq.com

通信作者

通信作者:
张鹏辉, E-mail: zhangph7203@sina.com

文章历史

收稿日期:2018-05-05
利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因c.392G>T (p.131G>V)突变位点的HEK293T稳定细胞株
周燕霞 , 胡韦维 , 张虹洋 , 邹琳 , 张鹏辉     
重庆医科大学附属儿童医院临检中心//儿童发育疾病教育部重点实验室//儿童发育重大疾病国家国际科技合 作基地//认知发育与学习记忆障碍转化医学重庆市重点实验室, 重庆 400014
摘要: 目的 利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因常见突变位点——c.392G>T (p.131G>V)突变位点的HEK293T细胞, 为后期研究其基因修复提供可靠的细胞模型。方法 针对G6PD基因c.392G>T (p.131G>V)突变位点靶向设计4对向导RNA (sgRNA), 构建表达Cas9-sgRNA的外源PX458质粒, 将其转染至HEK293T细胞内, 通过流式细胞术分选表达GFP荧光蛋白的细胞进行培养, 利用T7核酸内切酶1 (T7E1)酶切验证CRISPR/Cas9的剪切效率, 有限稀释法筛选单克隆细胞, 测序鉴定并检测G6PD mRNA、蛋白表达和细胞功能的改变。结果 成功构建基于G6PD基因c.392G>T (p.131G>V)突变位点的Cas9-sgRNA外源PX458质粒, T7E1酶切检测四对sgRNA的编辑效率分别为6.74%、12.36%、12.54%、2.94%。测序鉴定敲除G6PD基因c.392G>T (p.131G>V)突变位点的细胞株构建成功, 细胞G6PDmRNA、蛋白表达和G6PD酶活性降低, 细胞增殖能力下降, 维生素K3诱导细胞死亡增加。结论 本研究成功构建敲除G6PD基因c.392G>T (p.131G>V)突变位点的HEK293T稳定细胞模型, 为后期研究基因的修复奠定了基础。
关键词: G6PD    CRISPR/Cas9    基因敲除    HEK293T细胞    
Establishment of a stable HEK293T cell line with c.392G>T (p.131G>V) mutation site knockout in G6PD gene using CRISPR/Cas9 technique
ZHOU Yanxia , HUI Weiwei , ZHANG Hongyang , ZOU Lin , ZHANG Penghui     
Center for Clinical Examination, Children's Hospital of Chongqing Medical University, Ministry of Education Key Laboratory of Child Development and Disorders, China International Science and Technology Cooperation Base of Child Development and Critical Disorders, Chongqing Key Laboratory of Translational Medical Research in Cognitive Development and Learning and Memory Disorders, Chongqing 400014, China
Abstract: Objective To establish a stable HEK293T cell line with c.392G>T (p.131G>V) mutation site knockout in G6PD gene using CRISPR/Cas9 technique. Methods We designed 4 pairs of small guide RNA (sgRNA) for G6PD c.392G>T(p.131G>V) mutation site, and constructed exogenous PX458 plasmids expressing Cas9-sgRNA. The plasmids were transfected into HEK293T cells, and the cells expressing GFP fluorescent protein were separated by flow cytometry for further culture. After verification of the knockout efficiency using T7 endonuclease Ⅰ, the monoclonal cells were screened by limiting dilution and DNA sequencing to confirm the knockout. We detected the expressions of G6PD mRNA and protein and examined functional changes of the genetically modified cells. Results We successfully constructed the Cas9-sgRNA exogenous PX458 plasmid based on the c.392G>T(p.131G>V) mutation site of G6PD gene. The editing efficiency of the 4 pairs of sgRNA, as detected by T7E1 enzyme digestion, was 6.74%, 12.36%, 12.54% and 2.94%. Sanger sequencing confirmed that the HEK293T cell line with stable knockout of G6PD c.392G>T(p.131G>V) was successfully constructed. The genetically modified cells expressed lower levels of G6PD mRNA and G6PD protein and showed reduced G6PD enzyme activity and proliferative capacity and increased apoptosis in response to vitamin K3 treatment. Conclusion We successfully constructed a stable HEK293T cell model with G6PD gene c.392G>T(p.131G>V) mutation site knockout to facilitate future study of gene repair.
Keywords: G6PD    CRISPR/Cas9    gene knockout    HEK293T cells    

成簇规律间隔短回文重复序列及相关蛋白9 (CRISPR/Cas9)是一种新型基因编辑技术[1]。可实现目的基因的敲除、插入、定点替换等[2], 为基因治疗开启了新方向。已有文献报道CRISPR/Cas9技术用于地中海贫血[3]及杜氏肌营养不良(DMD/BMD)[4]等遗传疾病的实验研究。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)是磷酸戊糖途径(PPP)的关键酶[5], 可保护细胞免受氧化损伤。G6PD缺乏症是由于X染色体上G6PD基因突变导致红细胞破坏并溶血的一种最常见的血液系统遗传病[6], 临床表现主要为新生儿黄疸、急性溶血性贫血和慢性非球形红细胞溶血性贫血[7]。对于G6PD缺乏症患者, 目前尚无根治疗法, 主要以预防及在疾病发作时给予对症治疗, 严重者治疗效果不佳。因此, 在基因水平上修复其突变基因将有望根治这一疾病, 改善治疗现状, 具有较好的应用前景。

目前, 虽有CRISPR/Cas9技术纠正多种遗传疾病的研究报道[3-4], 但尚未用于G6PD缺乏症的研究。HEK239T是实验室常见的模式细胞, 对于基因修饰、编辑等研究具有重要作用[8]。本实验选取G6PD基因常见突变位点c.392G>T (p.131G>V), 利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点, 为后续研究G6PD缺乏症的基因修复构建稳定的HEK293T细胞模型。

1 材料和方法 1.1 材料和试剂

HEK293T细胞系、PX458质粒(实验室保存); 结晶紫染液、4%甲醛(实验室配置); 胎牛血清(ExCell Bio); DMEM培养基(Gibco); 氨苄西林抗生素(索莱宝); PBS磷酸盐结晶粉末(鼎国生物); 青霉素/链霉素100倍浓缩液、0.25% EDTA胰蛋白酶(Genview); Neofect转染试剂(零客创智生物技术); 酵母提取物、胰蛋白胨(Oxoid); 无内毒素质粒提取试剂盒(美基生物); 琼脂糖粉末(Gene); DH5α感受肽细胞、血液/组织/细胞基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生物); BbsⅠ核酸内切酶、EnGen?突变检测试剂盒、T4快速连接试剂盒、Q5 Hotstar高保真多聚核酸酶、T7E1核酸内切酶(NEB); Premix Taq(TaKaRa); 蛋白Marker (Thermo); ECL发光液(Millipore); 兔源G6PD抗体(CST); 兔源GAPDH抗体(武汉三鹰); 辣根酶标记山羊抗兔IgG抗体(北京中杉金桥); CCK8试剂盒(Genecopoeia); 6-磷酸葡萄糖脱氢酶测定试剂盒(中山生物工程); 维生素K3 (MCK); sgRNA合成、引物合成、测序服务均由北京六合华大基因有限公司完成。

1.2 实验方法 1.2.1 sgRNA和目的片段引物设计

根据CRISPR/Cas9的工作原理, 利用在线设计工具(http//crispr.mit.edu/)针对G6PD基因5号外显子c.392G>T (p.131G>V)突变位点设计向导RNA(sgRNA), 选择四对评分较高的sgRNA, 在正义链模板的5'端添加CACC, 反义链模板的5'端添加AAAC。同时依据目的基因的序列, 利用NCBI引物设计工具设计CRISPR/Cas9敲除鉴定引物G6PD-5F: 5'-TGTCTGTGCTGCCTGCTTT-3', G6PD-5R: 5'-TCC ACGAAACACCGCCTTT-3'。

1.2.2 sgRNA-PX458质粒的构建

用T4多聚核苷酸激酶使合成的单链sgRNA退火形成二聚体, 同时利用BbsⅠ核酸内切酶酶切PX458质粒并切胶回收, 再用T4连接酶将退火后的sgRNA与胶回收的PX458质粒连接过夜, 然后将质粒转化到DH5α感受态细胞中, 涂于氨苄青霉素抗性的LB平板上, 37℃培养12~14 h, 挑取单个菌落摇菌, 菌液提取质粒并测序鉴定。

1.2.3 HEK293T细胞培养及质粒转染

将HEK293T细胞用10%FBS的DMEM培养基常规培养, 转染前1 d将HEK293T细胞铺在10 cm平板中, 使转染时细胞密度生长至60%~80%为宜。按照Neofect转染试剂说明书加入10 μL质粒进行转染, 6 h后换液。24 h后在荧光显微镜下观察GFP绿色荧光, 确保质粒成功转染到细胞中。

1.2.4 流式细胞仪分选GFP+的HEK293T细胞并筛选单克隆细胞

转染HEK293T细胞48 h后, PBS缓冲液重悬细胞, 用流式细胞分选仪分选GFP阳性细胞, 将GFP阳性细胞采用有限稀释法接种至96孔板中, 待细胞形成单克隆集落后, 再接种于24孔板内培养, 长满后再接种至6孔板培养。

1.2.5 突变效率的验证及敲除G6PD基因c.392G>T (p.131G>V)突变位点HEK293T细胞株的鉴定

根据c.392G>T (p.131G>V)突变位点设计的引物5F和5R, 目的片段长度599 bp, 突变位点前后序列长度分别为336 bp和262 bp, 前后相差74 bp。提取分选后细胞的DNA, 用Q5 HotStar高保真多聚核酸酶PCR扩增目的片段并切胶回收, 回收产物进行T7E1酶切, 验证突变效率。筛选的单克隆细胞在6孔板内长满后, 提取基因组DNA, 经PCR扩增后将产物交给北京六合华大基因有限公司测序, 测序结果与目的序列进行比对。

1.2.6 敲除G6PD基因c.392G>T (p.131G>V)突变位点后细胞G6PD mRNA、G6PD蛋白的表达和细胞功能的变化

将敲除G6PD基因c.392G>T (p.131G>V)突变位点后的细胞扩增培养, 提取总RNA, 检测RNA浓度并按照逆转录试剂盒说明书逆转录为cDNA, 跑定量PCR检测其G6PD mRNA的表达情况。取部分细胞沉淀提取蛋白质, 进行SDS-PVDF电泳, 室温封闭1 h后, 用稀释好的兔源G6PD抗体孵育过夜, TBST洗膜, 辣根酶标记山羊抗兔IgG抗体室温孵育1 h, 洗膜后, 用ECL发光液检测结果, 重复3次, 利用Image J软件计算目的条带和内参条带光密度值。取部分细胞沉淀, 用G6PD酶活性测定试剂盒(比值法)测定细胞G6PD酶活性的改变。将对数生长期的细胞以1.5×104/mL的密度, 传至96孔板, 每孔200 μL, 每组设计4个复孔, 37℃培养24、48、72、96、120、144 h, 每孔加入10 μLCCK8试剂, 振荡混匀后培养2~3 h, 读取450 nm处吸光度(A)来测定细胞的增殖功能。将两组对数生长期的细胞铺板到六孔板, 每孔细胞数5×105, 37℃培养6 h后每孔加入维生素K3, 使其浓度依次为0、5、10、15、20、40 μmol, 培养12 h后用4%甲醛固定30 min, 结晶紫染色, 根据染色深浅及面积判断细胞存活多少。

1.2.7 统计学处理

采用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析, 两组间采用独立样本的T test比较, 以P < 0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 sgRNA靶位点的选择和设计

为了提高CRISPR/Cas9的敲除效率, 选择4对评分较高的针对G6PD基因5号外显子c. 392G>T (p.131G> V)突变位点的sgRNA (图 1), 在5'端添加相应碱基(表 1), 并设计敲除鉴定引物序列, 送北京六合华大基因有限公司合成。

图 1 靶向G6PD基因c.392G>T (p.131G>V)突变位点的sgRNA设计 Fig.1 Design of sgRNA targeting G6PD c.392G>T(p.131G>V) mutation site. A: Structure of PX458 plasmid; B: Recognition sequence of sgRNAtargeting Exon 5.
表 1 sgRNA寡核苷酸序列 Tab.1 Sequences of sgRNA oligonucleotides
2.2 PX458-sgRNA载体的构建

用BbsⅠ酶切PX458质粒并胶回收, 将sgRNA退火成双链, 再用T4连接酶将sgRNA与酶切后胶回收的质粒连接。连接产物经转化、摇菌、提质粒后, 送北京六合华大基因有限公司测序, 结果显示4对sgRNA序列均正确插入PX458质粒(图 2), 提示载体构建成功。

图 2 PX458-sgRNA测序图 Fig.2 Sequence maps of sgRNA1-PX458 (A), sgRNA2-PX458 (B), sgRNA3-PX458 (C) and sgRNA4-PX458 (D).
2.3 转染sgRNA-PX458质粒到HEK293T细胞

质粒转染后24 d在荧光显微镜下观察HEK293T细胞及其荧光强度, 4对sgRNA-PX458质粒转染后的细胞均可见绿色荧光, 表明质粒转染成功(图 3), 且荧光强度高, 表明质粒转染效率较高。

图 3 转染sgRNA-PX458质粒24 h后HEK293T细胞GFP表达 Fig.3 GFP expression in HEK293T cells at 24 h after transfection with sgRNA-PX458 plasmid (Original magnification: 10×10).
2.4 T7E1酶切验证突变效率及敲除G6PD基因c.392G> T (p.131G>V)突变位点HEK293T细胞株的鉴定

PCR扩增分选后细胞的目的片段, 并用2%琼脂糖凝胶电泳(图 4A), T7E1酶切产物用2%琼脂糖凝胶电泳条带(图 4B), 可见sgRNA1、2、3均出现被T7E1内切酶剪切的两条带, 说明转染后细胞DNA被编辑, 使用Image J软件分析条带灰度值之比和公式(% Modification=100×[1-(1-fraction cleaved)1/2])计算突变率(图 4C), 4对sgRNAs对HEK293T细胞DNA编辑效率分别为6.79%、12.41%、12.54%、2.19%。

图 4 T7E1酶切和DNA测序结果 Fig.4 Results of T7E1 digestion and DNA sequencing for verifying stable G6PD gene knockout in HEK293T cells. A: PCR amplification of the target fragment of HEK293T cells; B: T7E1 cleavage of mismatched fragment, showing positive results for sgRNA 1, 2, and 3; C: Image J software analysis of the gray value of the band to calculate the mutation rate; D: Monoclonal cell sequencing showing successful knockouts; E: Comparison of c.392G>T(p.131G>V) sequence in sgRNA-3 with the original sequence.

流式分选的GFP阳性细胞, 采用有限稀释法筛选单克隆HEK293T细胞株, 待细胞在6孔板内扩增后, 取部分细胞提取基因组DNA, 经PCR扩增后送北京六合华大基因有限公司测序, 测序结果与原序列进行比对(图 4D), 有一株细胞发生了6个碱基的缺失突变, 缺失碱基包括G6PD基因c.392G>T (p.131G>V)突变位点, G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点敲除的HEK293T细胞模型构建成功。

2.5 敲除G6PD基因c.392G>T (p.131G>V)突变位点后HEK293T细胞G6PD基因表达情况与细胞功能的改变

将敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点后的HEK293T细胞扩增培养, 提取RNA, 逆转录定量PCR验证其G6PD mRNA的表达水平, 经T检验, 敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点后G6PD mRNA表达下降(P < 0.005, 图 5A)。Western blot结果显敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点后HEK293T细胞G6PD蛋白表达水平降低(图 5BC, P < 0.05)。利用CCK8法检测稳定敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点后细胞增殖能力, 结果示敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点后HEK293T细胞增殖能力下降(图 5D); 取部分HEK293T细胞沉淀测定G6PD酶活性, G6PD基因c.392G>T (p.131G>V)突变位点敲除后细胞G6PD酶活性降低10%~20% (P < 0.005, 图 5E)。使用G6PD缺乏症患者禁用的药物维生素K3来观察敲除G6PD基因c.392G>T (p.131G>V)突变位点后HEK293T细胞对药物使用的影响, 用药后实验组细胞死亡明显多于对照组, 且随着药物浓度升高差异越大(图 5F)。

图 5 G6PD c.392G>T (p.131G>V)突变位点敲除后对HEK293T细胞G6PD表达和功能的影响 Fig.5 Expression of G6PD and cell function in HEK293T cells knockout G6PD c.392G>T (p.131G>V). A: The expression of G6PD mRNA in HEK293T cells with G6PD c.392G>T(p.131G>V) knockout; B: Expression of G6PD protein detected by Western blotting in HEK293T cells with G6PD c.392G>T(p.131G>V) knockout. GAPDH was used as the loading control. C: Statistical analysis of the protein levels; D: Effect of G6PD c.392G>T(p.131G>V) knockout on the proliferation of HEK293T cells; E: Activity of G6PD enzyme in HEK293T cells with G6PD c.392G>T(p.131G>V) knockout; F: Vitamin K3 induced apoptosis in HEK293T cells with G6PD c.392G>T(p.131G>V) knockout. *P < 0.05, **P < 0.01.
3 讨论

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症是最常见的人类酶缺陷, 全球超过4亿人受累[9], 我国G6PD缺乏症患病率约为0.2-5.48%, 呈南高北低趋势[10]。目前报道的G6PD基因突变型有217种[11], 多为单个碱基置换导致的错义突变, 在中国已发现30多种突变类型, 最主要的突变位点为c.392G>T (p.131G>V)、c.95A>G (p.32H>R)、c.1376G>T(p.459R>L)和c.1388G>A(p.463R>H)[12]。研究表明, G6PD缺乏症与疟疾分布有显着的地理相似性[13-14], 而临床最常用的抗疟药物——伯氨喹, 服用后常引起G6PD缺乏症患者严重溶血[15]。此外, 磺胺类、镇痛药、砜、亚甲蓝、维生素K3、萘和拉布立酶等[16-18], 均可引起G6PD缺乏症患者发生急性溶血。G6PD缺乏还可导致机体易受病毒感染, 如冠状病毒229E[19]和肠道病毒71型[20]等, 且多种感染性疾病如甲型肝炎病毒A[21]和巨细胞病毒[22]均被认为是G6PD缺乏症患者急性溶血的触发因素。G6PD缺乏症是新生儿发生病理性黄疸的主要原因, 且高胆红素血症可诱发胆红素脑病, 留下严重后遗症甚至死亡[23], 给家庭造成极大的精神压力和经济负担。目前针对G6PD缺乏症患者的治疗以预防和对症治疗为主, 在基因水平上修复这些突变位点将改善这一现状。而且CRISPR/ Cas9具有非常强的基因编辑能力, 已经有该技术应用于多种遗传性疾病的研究报道, 如四氢生物蝶呤(BH4)缺乏症[24]、杜氏肌营养不良[4]、α1-抗胰蛋白酶缺乏症[25]、X-连锁慢性肉芽肿病[26]及单基因血液系统遗传病范尼可贫血(FA)[27]、血友病B[28]、β-地中海贫血[3]和镰状细胞性贫血[29]等。由此可见, 从基因水平上修复G6PD缺乏症患者的突变位点, 进而治疗这一疾病, 具有较好的可行性和临床应用前景。

本实验利用CRISPR/Cas9系统成功构建敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T细胞系, DNA测序结果表明该细胞株中G6PD基因5号外显子产生了6 bp的缺失突变, 说明sgRNA3-PX458质粒转染HEK293T细胞后, sgRNA3靶向G6PD基因5号外显子, 随后Cas9核酸酶在靶位点产生DNA双链断裂[2], 细胞DNA在修复过程中, 产生了6 bp的缺失突变[30], 导致细胞G6PDmRNA的下降, 引起G6PD蛋白表达降低, 从而导致细胞G6PD酶活性的降低。本研究还初步探讨了敲除G6PD基因c.392G>T (p.131G>V)突变位点后, 对HEK293T细胞的增殖能力及细胞抗氧化能力的影响。敲除G6PD基因c.392G>T (p.131G>V)突变位点后, HEK293T细胞增殖能力明显下降。维生素K3在细胞内有电子转移的作用, 具有氧化功能, 是G6PD缺乏症患者禁用的药物, 在细胞培养液中加入维生素K3, 敲除G6PD基因c.392G>T (p.131G>V)突变位点后的HEK293T细胞死亡明显多于对照组, 且随着维生素K3浓度的增加差异越大。Lichun Tang等[31]运用sgRNA和同源供体复合的Cas9蛋白注入单细胞人胚胎中, 证明有效的同源重组可介导G6PD基因中点突变的校正。已报道的G6PD基因突变中约83.9%为单基因突变, 其中约一半为WHO-I型[11], 导致严重的慢性溶血性贫血, 临床治疗效果不佳。根据sgRNA引导cas9蛋白在PAM区上游的3~8碱基处切割目的DNA[32]的工作原理, 利用CRISPR/ Cas9技术可修复包括c.392G>T (p.131G>V)、c.1376G> T(p.459R>L)、c.1388G>A(p.463R>H)和c.95A>G (p.32H>R)等我国最常见几种突变的大部分突变位点。本实验成功构建了敲除G6PD基因c.392G>T (p.131G>V)突变位点的HEK293T稳定细胞株, 为其基因修复奠定了基础。

CRISPR/Cas9系统虽然操作简便, 但转染效率和脱靶效应影响其基因编辑效率。针对不同序列设计的sgRNA特异性高低不一, 使得CRISPR/Cas9系统在不同基因中体现出的编辑效率大相径庭。虽然T7E1酶切后计算出的突变效率较高, 但在筛选单克隆细胞时发现部分敲除位点不包含c.392G>T (p.131G>V)突变位点。因此, 本实验还需进一步优化实验条件以提高CRISPR/Cas9系统的靶向编辑效率, 如更换外源CRISPR/Cas9系统转染方式、采用两对sgRNA同时引导Cas9蛋白对靶位点前后序列同时切割等[33], 为后期在患者来源的细胞中进行基因修复筛选出最佳条件。

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